Metodiky stanovení genových polymorfismů

1. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) je technika, která umožňuje diferenciaci genomů na základě spektra DNA fragmentů, které vzniknou po štěpení genomové DNA restrikčními endonukleázami. Jestliže se dva genomy liší zdáleností mezi pozicemi štěpení určitou restriktázou, pak se vzniklé fragmenty budou lišit svojí délkou, pokud budou genomy rozštěpeny právě touto restriktázou. Podobnost spekter genomů vzniklých metodou RFLP značí obecně příbuznost těchto genomů.

Metoda RFLP byla vyvinuta v 80. letech a byl to první genetický test založený na bázi DNA. Má celou řadu různých využití, jednou z možností je identifikace genů zodpovědných za určitá onemocnění.

Základem techniky je štěpení genomové DNA restrikčními endonukleázami. Tím vzniká velké množství fragmentů, které jsou rozděleny podle velikosti elektroforézou v agarózovém gelu. Pro restrikční štěpení se používají restriktázy, které štěpí specifické sekvence o délce 4 nebo 6 bp. Teoreticky to znamená, že v úplně nahodilé sekvenci štěpí takové enzymy 1x za 44 (256) bp nebo 46 (1 296) bp. Vzniklé spektrum fragmentů genomové DNA je v takovém případě nepřehledné a nehodnotitelé. Proto se k analýze využívá jen malá část vzniklých fragmentů. To, která část genomové DNA je použita je dáno tzv. „sondou“, krátkým fragmentem genomové DNA, který hybridizuje s komplementárními sekvencemi genomové DNA. Sonda tak vyhledává mezi mnoha fragmenty genomové DNA jen některé, které v konečném důsledku vytvářejí výsledné spektrum.