Extrakce DNA z nezralého plodu třešně ptačí

Cíl laboratorního cvičení: Cílem laboratorního cvičení byla separace DNA z části rostlinného materiálu. K dispozici jsme měli embryo a živná pletiva Třešně ptačí.

Pomůcky: čistý bílý papír (pracovní plocha), nezralý plod třešně ptačí (fyziologicky mladé pletivo, bez kontaminace), sterilní skalpel, mikrozkumavky (1,5 ml, 2 ml), pipety (1-20 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl) (Obr. 7), jednorázové špičky na pipety, skleněné kuličky, Prefilter, Spin filter, Petriho miska, Oscilační mlýn, Vortex, Thermomixér, Centrifuga.

Pracovní postup:
1. Příprava
Jako první jsme byli seznámeni s bezpečností práce v laboratoři. Následovalo seznámení s pomůckami, které jsme během laboratorního cvičení používali.
2. Preparace vzorku
Pomocí sterilního skalpelu jsme na připraveném čistém papíru vypreparovali ze zmraženého plodu třešně embryo a osemení (Obr. 1), které jsme následně rozkrájeli na menší části, pro lepší rozmělnění vzorku (Obr. 2). Tento připravený vzorek jsme vložili do mikrozkumavky, společně se dvěma skleněnými kuličkami. Mikrozkumavku jsme na dvou místech označili číslem skupiny, v našem případě číslem T17.
3. Mražení
Mikrozkumavku jsme vložili do stojanu, který byl vložen do polystyrenové krabice pomocí kleští (Obr. 3, 4). Následně proběhlo zmražení vzorku zalitím tekutého dusíku na teplotu -196°C. Celý tento krok prováděl proškolený vědecký pracovník.
4. Drcení
Po zmražení byla mikrozkumavka vložena do bloku v oscilačním mlýnu, který narušil biologickou strukturu pro DNA extrakci. Frekvence oscilace byla 30 otáček. Drcení trvalo celkem 4 minuty (Obr. 5).
5. Přidání Lysis Buffer P (Obr. 6)
Rozdrcený vzorek jsme přemístili do 1,5 ml mikrozkumavky a přidali jsme pipetou 400 µl Lysis Buffer P. Mikrozkumavku s touto směsí jsme přiložili na třepačku Vortex (Obr. 8) kvůli promíchání vzorku (pozn. vše pevné musí být v roztoku). Následně jsme mikrozkumavku vložili do thermobloku (Obr. 9), kde byla zahřáta na teplotu 65°C po dobu 30 minut.