Mikrobiologické laboratorní metody

1. KULTIVAČNÍ METODY

Zlatým standardem při hodnocení mikrobiologické kvality potravin stále zůstává, i přes velký rozvoj alternativních metod, kultivační vyšetření. Kultivační metody jsou obvykle metodami referenčními, umožňují jak kvantitativní tak kvalitativní stanovení.

Cílem kvantitativních metod je stanovení počtu životaschopných buněk cílové skupiny mikroorganismů. Mezi základní techniky patří metoda zalití, metoda roztěru a metoda stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů (MPN, Most Probable Number). Stanovení počtu některých mikroorganismů (zejména patogenů) může být rozšířeno o krok resuscitace, jehož cílem je zachycení i stresovaných či subletálně poškozených buněk. Jednou z možností je např. využití membránových filtrů, které se po filtraci nejdříve krátce kultivují na neselektivním médiu a teprve poté se filtr umístí na selektivní agar (stanovení počtu Escherichia coli O157 v potravinách). Další možností je homogenizace vzorku v neselektivní či částečně selektivní tekuté půdě a jeho krátká resuscitace při laboratorní teplotě, jako je tomu např. při stanovení počtu Listeria monocytogenes.

Kvalitativní stanovení je zaměřeno na průkaz přítomnosti či absence cílového mikroorganismu v dané navážce vzorku. Tento typ stanovení je časově i materiálově náročnější a obvykle probíhá v několika na sobě navazujících stupních - primární pomnožení (předpomnožení), sekundární pomnožení, izolace a konfirmace. Cílem předpomnožení (neselektivní tekuté médium) či primárního pomnožení (selektivní tekutá půda se sníženou koncentrací inhibičních složek) je mimo jiné resuscitace stresovaných či subletálně poškozených cílových buněk. Během sekundárního pomnožení se výrazně zvyšuje počet cílových mikroorganismů. Při stanovení některých mikroorganismů se využívá pouze jeden pomnožovací krok (např. stanovení termotolerantních druhů rodu Campylobacter). Pomnožený vzorek se izoluje na pevných selektivních či selektivně diagnostických agarech. Růst cílového mikroorganismu se projeví vznikem kolonií s typickou morfologií, příp. doplněnou o charakteristické změny živného média. Protože jenom velmi málo používaných diferenciálních živných médií je zcela specifických, je nejen při kvalitativním stanovení nezbytné provést vhodnými metodami konfirmaci suspektních kolonií cílových mikroorganismů.